干货 | 皮下成瘤实验解析
手拿把掐教你使用基质胶！
GelNest™基质胶是由小鼠肿瘤组织中提取的基底膜成分制备而成，包含的主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸肝素糖蛋白等。这些成分可以提供细胞黏附、分化和增殖所需的支持和信号，同时也可以模拟生理环境中基底膜的特性，提高细胞培养的成功率和效果。除了基底膜成分，GelNest™基质胶中还富含多种生长因子。这些生长因子可以促进细胞分化、增殖和迁移，从而进一步模拟生理环境中的细胞信号通路和互动。
GelNest™基质胶具有广泛的应用前景，特别是在组织工程、细胞培养和研究等方面，可被用于类器官培养、干细胞分化、血管生成、迁移或侵袭和体内肿瘤发生等研究。
本文针对基质胶在裸鼠皮下成瘤实验中的应用方法进行解析。
概述
皮下成瘤实验一般选用4-8周龄的小鼠。伦理学通常要求接种肿瘤细胞数量不可超过1×107个/只。成瘤速度根据细胞的成瘤性、增殖速度、细胞接种量、小鼠品系等因素有所差异。药物干预周期一般为0.5-2个月。
裸鼠是由于nu基因有独特的遗传特性，成为科学研究中具有巨大潜力的试验模型。经过世界各国实验动物遗传育种学家的努力，已将nu基因导入不同近交系动物，成为系列动物模型，仅小鼠模型一种，已建立了二十余种近交系裸鼠。
常见成瘤细胞
较容易成瘤的细胞：
Hep-G2（肝癌），Hep2（喉癌），NCI-H460(大细胞肺癌)， A431(表皮癌)，SK-OV-3（卵巢癌），MCF-7（乳腺癌）SKBR3， A375/B16-F10（人黑色素瘤细胞），SGC7901 人胃肿瘤细胞 ，KB人口腔表皮样癌细胞
可以成瘤但是比较慢的细胞：
CNE（鼻咽癌），A549（肺癌）， SPC-A-1（肺腺癌）， HT-29（结肠癌），BEL-7402（肝癌），MDA-MB-231 乳腺癌 ， CT26 （小鼠结肠癌细胞 ），SH-SY5Y (人神经母细胞瘤细胞 ) ， U251 （人胶质瘤细胞） ， BGC-823（人胃癌细胞） ，PC-3 （人前列腺癌细胞）
一些比较有争议的细胞：
Hela（宫颈癌），HCT（人回盲肠癌细胞/人结直肠癌腺癌细胞）。
其他：
BMSC（骨髓间充质干细胞）
操作流程
（以Hep-G2细胞为例）
01
将Gelnest™基质胶（高浓度）置于冰中并在4℃过夜融化，使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。
注：高浓度低因子基质胶的成瘤更快。
02
细胞收集：准备对数期生长的、细胞密度达80-90%左右的Hep-G2细胞，于收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。胰酶消化细胞，待细胞变圆未脱离培养皿时，去除胰酶，加入无血清培养基制成细胞悬液。收集的细胞悬液300×g离心5分钟，PBS洗涤2次。PBS重悬细胞至终浓度为8×10^7个细胞/mL。将细胞置于冰上待用。
注：1.悬浮细胞直接收集细胞悬液，贴壁细胞用胰酶消化后收集细胞悬液。
2.收集的细胞宜在1小时内接种完毕。
03
将细胞悬液与基质胶在4℃环境下按照1:1的比例混匀，制备成终浓度为0.5×10^7-5×10^7个细胞/mL。
注：细胞悬液与基质胶混合液需置于冰上以减缓细胞凋亡并防止基质胶凝固。
04
使用实验动物电动剃毛器对小鼠注射部位皮肤进行脱毛，然后用酒精棉球进行消毒。
消毒
05
用不带针头的1mL注射器将细胞悬液与基质胶混合液吸入注射器，再装上针头。
注：吸取混合液前可用注射器缓慢吹打以混匀细胞。
06
左手抓取固定裸鼠，于裸鼠左侧腋窝处皮下注射，接种时，针头在皮下进针深一点，约1cm深，以减少注射后细胞悬液从针眼溢出。接种体积通常为100µL/只。
注：这一过程尽量在半小时内完成，途中细胞悬液放在冰上以减缓细胞凋亡及防止出现凝胶现象。
排空入针口
接种
接种后观察
07
将裸鼠放回笼内继续饲养，约1-3周可观察到较明显的瘤块，并根据实验设计在肿瘤体积不超过1000mm^3前对裸鼠进行安乐死，取出肿瘤，拍照。
肿瘤测量
肿瘤活体荧光
常见问题与解答
Q1：常见的荷瘤不成功可能的原因？
A：
（1）细胞的状态是成瘤实验的关键，所以细胞生长状态一定要好，取处于对数生长期的细胞，细胞达80-90%左右密度为宜，收集细胞前一天晚上更换新鲜培养基。需加入基质胶辅助或增大接种量或更换细胞系；
（2）可能是小鼠周龄太大，一般选择5-6周龄裸鼠，小于4周可能不耐受过早死亡，大于6周免疫力会增强，不易成瘤。
（3）可能是小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（NSG（包括NOG、NCG，B-NDG等）＞Nod-scid小鼠＞Nude裸鼠）。
（4）接种部位也是成瘤实验的重要因素。选择血管丰富且易操作的部位接种，如腋下、腹股沟、侧腹部及颈背部等部位，其中腋下中后部皮下较好，成瘤率高，比较推荐打腋下，一人操作很方便，后续量瘤子也很好操作。
Q2:肿瘤长起来后又消失的原因？
A：肿瘤生长过程中，如果出现肿瘤块先缩小，后变大的现象，很可能是由于炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收造成的。
继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，如若后续肿瘤依旧未长出来，可考虑更换免疫缺陷程度更大的小鼠。
Q3：造成肿瘤均一性很差的原因？
A：首先，并不是所有的肿瘤都能够长得均一形态。肿瘤生长不宜过大，一般直径不超过15mm，体积不超过2000mm^3
其次，如果同一分组内小鼠肿瘤体积差距很大，可能是由于小鼠的周龄及接种细胞量不一致造成的，建议重新接种。
Q4：是否可以应用免疫抑制剂加速肿瘤生长？
A：一般不建议加免疫抑制剂，有限考虑选择免疫缺陷程度更高的小鼠品系。
一、质量控制介绍
二、选用指南
三、储存及操作注意事项
GelNest™基质胶在分装前可以保存于 -20℃冰箱。初次使用时，应融化后按照单次用量分装，并保存于 -80° C 冰箱，有效期 2 年。注意不要使用无霜冰箱储存 GelNest™基质胶。
GelNest™基质胶在 4℃下呈液态，在 37℃时会形成凝胶态，在温度高于 10°C 时就会开始凝固成胶，请预冷移液吸头并尽量在冰上操作。
