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2023-12-0111525 次浏览
细胞疗法 | 被誉为第三次医学革命的iPSC治疗技术神在哪里?

细胞疗法是近年来医药研发中发展非常迅速的一个领域,其主要的治疗方式为免疫细胞治疗和干细胞治疗。干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞,根据不同的分化潜能分类可分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞,其具有多向分化潜能、无限地分裂、增殖等特性。

诱导多能干细胞(iPSC)治疗技术被誉为是继药物治疗和手术治疗之后的第三次医学革命,是近年来国际医学前沿重点发展领域,为整个干细胞生物学领域和临床再生医学提供了新的研究方向。


01

iPSC的定义

诱导多能干细胞(iPSC),又称人工诱导多能干细胞,是将一系列诱导因子导入到成熟体细胞中,并重编程为具有类似胚胎干细胞特征的一种多能干细胞。

iPSC可以通过CRISPR/Cas9基因编辑产生同基因对照细胞系,在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞极为相似,具备和胚胎干细胞一样的应用潜能。


02

iPSC的优势

  • iPSC的致瘤系数远低于胚胎干细胞和间充质干细胞。

  • iPSC可以由成体细胞直接诱导而成,打破了干细胞研究中不可回避的伦理道德和免疫排斥等局限,为干细胞的临床应用和研究提供了一个全新视角。

  • iPSC与其他来源于人体的干细胞一样,具有超强的分化再生能力、且免疫原性低。在再生医学、筛选和开发新药领域应用广泛。

  • 由患者自身的细胞诱导获得,因此极大地解决了潜在的免疫排斥问题。


03

iPSC的应用

     再生医学:

iPSC具有超强的分化能力,在特定条件下,可诱导分化成人体所需的不同类型的细胞,甚至类器官;


      疾病建模:

由于iPSC固有的自我更新特性和分化为体内几乎任何细胞类型的潜力,患者特有的iPSC可以提供大量与疾病相关的细胞和以前无法获得的各种不同类型的细胞(如神经元和心肌细胞),实现个性化的疾病建模,这将成为精准医学的核心部分;


     新药研发:

研究人员可以使用培养的干细胞来测试药物的效用,了解药物治疗的可能性,这对研究人员新药研发的助力是不可预估的。


疾病及衰老患者,

通过iPSC再生医学管理诱导多能干细胞,

用介入方式注入诱导多能干细胞使细胞器官功能恢复


04

iPSC培养指南


划重点:

1.iPSC培养过程中不建议使用抗生素,抗生素会影响细胞的活性和分化潜能。

2.iPSC培养环境应与其它细胞隔离,两次传代后检测支原体。


01基质胶用于多孔板的包被:

(1)将Gelnest™基质胶(干细胞专用)置于冰中并在4℃融化,使用预冷的移液管或吸头混合基质胶至均匀状态。


注:GelNest™基质胶是由小鼠肿瘤组织中提取的基底膜成分制备而成,包含的主要成分有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白硫酸肝素糖蛋白等,更含有多种多种生长因子。这些成分可以提供细胞黏附、分化和增殖所需的支持和信号,模拟生理环境中基底膜的特性,从而进一步模拟生理环境中的细胞信号通路和互动,提高细胞培养的成功率和效果。


(2)在冰上,将基质胶与DMEM培养液按照1:80或1:100的比例混匀,例如取1mL基质胶加入80mL或100mL DMEM培养液中,使用预冷的移液管混合至均匀状态。


注:可根据实验具体情况调整稀释比例。

(3)将6孔板置于冰上,按照每孔1mL向6孔板中加入稀释后的基质胶。


(4)将6孔板置于37℃孵育过夜。

注:一般情况下,孵育1小时即可使用,但过夜孵育的细胞培养效果更好。

(5)使用前吸出未结合的基质胶。

注:需确保移液管的尖端不会刮伤涂层表面。


02 Y-27632 (ROCK抑制剂)溶液的配制

将Y-27632 溶于PBS中,配制成10mM的Y-27632溶液,例如取2.47mg Y-27632溶于1mL PBS中,即得1mL 10mM Y-27632溶液。

注:Y-27632的工作浓度为10µM。


03配制含Y-27632的人胚胎干细胞培养液(如mTeSR™1或TeSR™-E8™)

取Y-27632溶液与mTeSR™1培养液按照1:1000的比例混匀,例如取10µl Y-27632溶液加入10mL mTeSR™1培养液中,即得10mL含10µM Y-27632的mTeSR™1培养液。


04 iPSC复苏:

(1)将冻存的iPSC置于37℃水浴迅速解冻,将细胞溶液转移至离心管中,用DMEM培养液冲洗冻存管两次并转移至离心管中,与管中细胞合并,室温300×g离心5分钟。

(2)弃上清,用2mL含Y-27632的mTeSR™1培养液重悬iPSC,随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板的1个孔中,置于培养箱中培养。

注:建议将每支复苏的细胞(约100万个)转移至6孔板的1个孔中培养使细胞存活率最大化。

(3)第二天对iPSC进行换液,将含Y-27632的mTeSR™1培养液更换为不含Y-27632的mTeSR™1培养液。


注:可使用耐思新推出细胞复苏仪替代原始细胞复苏过程,细胞复苏时间短,细胞存活率高。


05 iPSC传代:

注:iPSC细胞生长至单层后会迅速分化并死亡,为保持其活性和多能性,需在长满前进行传代。

(1)去上清,用1mL PBS洗涤1次,加入1mL适当的细胞消化液

(2)将培养板转移至培养箱中孵育3分钟。显微镜下观察,大部分细胞脱落,若细胞仍附着,可以用手轻轻拍打培养板底部使细胞脱落。

(3)将消化下来的细胞转移至离心管中,用DMEM培养液洗涤培养板表面两次并转移至离心管中,与管中的细胞合并,室温300×g离心5分钟。

(4)弃上清,用含Y-27632的mTeSR™1培养液进行重悬,随后将细胞悬液转移至基质胶包被好的6孔板中,置于培养箱中培养。


06iPSC冻存:

NEST生物样本库系列含有全规格细胞冻存管及冻存液,操作简单,安全无菌。


(2)参考细胞冻存液的相关步骤进行细胞消化。

(3)计数,弃上清,加入适量冻存液,以每管1mL冻存液(约100万个细胞)分装至冻存管中。

(4)将细胞冻存管放置于可逐步降低温度的NEST程序降温盒内并放置在-80℃冰箱内,确保冷却速度约为1℃/分钟。通常冷却速度不宜快于0.5℃/分钟。

(5)放置在-80℃冰箱内约24小时后转移至液氮气相中保存。


iPS细胞的成功诱导给细胞治疗及再生医学研究开辟了全新的道路。相信在不久的将来,iPSC技术能快速突破瓶颈,NEST也将持续研发新品,推动再生医学的蓬勃发展,为患者带来新生的希望!


05

NEST基质胶选用指南